NGS方法已被廣泛用于檢測(cè)大多數(shù)序列變異。然而，這些方法無(wú)法準(zhǔn)確解析基因組中復(fù)雜的重復(fù)或高GC含量區(qū)域。這使得結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)尤其具有挑戰(zhàn)性。利用Bionano 光學(xué)基因組圖譜技術(shù) (Optical genome mapping,OGM)，可以在高靈敏度下以無(wú)偏、全基因組的方式檢測(cè)結(jié)構(gòu)變體。這項(xiàng)革命性的技術(shù)揭示了傳統(tǒng)測(cè)序和細(xì)胞遺傳學(xué)分析之前的“盲點(diǎn)”；然而，它需要分離超高分子量（UHMW）DNA。超長(zhǎng)分子的長(zhǎng)度通常在250 kbp以上甚至超過(guò)1 Mbp，傳統(tǒng)的提取方法很難完整獲取。為了應(yīng)對(duì)這一技術(shù)挑戰(zhàn)，Hamilton與Bionano Genomics合作開(kāi)發(fā)了提供超高分子量DNA提取的自動(dòng)化解決方案-Long String VANTAGE. 這使得基因組DNA提取過(guò)程中大大減少了碎片的產(chǎn)生。從這一自動(dòng)化過(guò)程中提取的超高分子量DNA進(jìn)而被標(biāo)記，并為光學(xué)基因組作圖（OGM）分析生成高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

在不斷發(fā)展的基因組研究領(lǐng)域，技術(shù)創(chuàng)新為深入了解以前尚未解決的基因組生物學(xué)問(wèn)題提供了機(jī)會(huì)。超長(zhǎng)DNA分子的繪圖改變了我們看待基因組的方式，對(duì)其結(jié)構(gòu)的分辨率達(dá)到了很高的水平。Hamilton提供超高分子量DNA提取的自動(dòng)化解決方案-Long String Vantage. 利用這種高效、省時(shí)的樣本處理解決方案，可以更高通量的實(shí)現(xiàn)光學(xué)基因組作圖（OGM）。

方法描述

‍該方法基于 Bionano Prep SP 冷凍細(xì)胞沉淀 DNA 提取方法，并對(duì)自動(dòng)化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。簡(jiǎn)言之，將約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的冷凍 HL-60 細(xì)胞沉淀手動(dòng)重懸于含有 RNase A 的 DNA 穩(wěn)定緩沖液中，并放置在96深孔板中。后續(xù)步驟將在Long String VANTAGE 儀器上自動(dòng)化執(zhí)行。

細(xì)胞裂解和蛋白酶 K消化將在特制緩沖液中進(jìn)行。隨后通過(guò)加入 PMSF 終止該過(guò)程。通過(guò)加入異丙醇將 UHMW DNA 結(jié)合到 Bionano Prep SP Disk上。隨后進(jìn)行3個(gè)洗滌步驟，從結(jié)合的DNA中去除雜質(zhì)。對(duì)于最終洗脫，將Disk轉(zhuǎn)移至微孔板頂部的預(yù)填充洗脫緩沖液條中。

最后，用戶可以在臺(tái)面外進(jìn)行離心步驟，將最終洗脫液留在微孔板中，將Disk保留在 Hamilton 洗脫條中。該過(guò)程獲得了適用于 Bionano Genomics 下游直接標(biāo)記和染色 (DLS) 過(guò)程的 UHMW DNA 提取物。該過(guò)程基于酶法進(jìn)行基因組特異性標(biāo)記，最終可在Bionano Genomics Saphyr ®系統(tǒng)上收集數(shù)據(jù)。

系統(tǒng)描述

Long String VANTAGE 是一種即用型工作站，具有標(biāo)準(zhǔn)化硬件配置，適用于自動(dòng)化magnetic disk或磁珠處理工作流程。本品僅適用于研究用途 (RUO)。其基于Microlab ®VANTAGE平臺(tái)，具有4個(gè)1 mL CO-RE ®移液通道以及4個(gè)用于disk處理步驟的5 mL CO-RE®通道。

應(yīng)用軟件

Long String VANTAGE VENUS框架是專門(mén)為該方法而設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)的。

試劑盒描述

Bionano 的 SP 血液和細(xì)胞培養(yǎng) DNA 分離試劑盒 (80042) 是在Long String VANTAGE 上開(kāi)發(fā)UHMW DNA 提取自動(dòng)化工作流程的基礎(chǔ)。該方法通過(guò)簡(jiǎn)單的裂解、結(jié)合、洗滌和洗脫流程來(lái)獲得UHMW DNA。該試劑盒使用的是由納米結(jié)構(gòu)二氧化硅表面覆蓋的順磁盤(pán)，而不是磁珠或硅基離心柱。這提供了高 DNA 結(jié)合能力，并有助于保護(hù)結(jié)合的 DNA 免受剪切力破壞。回收的 UHMW DNA 大小通常在 250 kbp 至 > 1 Mbp之間，濃度范圍為50-120 ng/µL。

可視化流程

使用人白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞沉淀測(cè)試自動(dòng)化方案。

HL-60細(xì)胞（DMSZ，ACC3）在DMEM+10%FBS和雙抗培養(yǎng)基中于37°C，含5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并在使用前作為1.5 M HL-6細(xì)胞的細(xì)胞沉淀在-80°C下冷凍存儲(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將細(xì)胞沉淀在37°C下解凍30秒，并通過(guò)手動(dòng)移液將其重懸于40μL DSB/RNase Cocktail混合液中。將得到的細(xì)胞懸浮液合并，將對(duì)應(yīng)于100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的體積轉(zhuǎn)移到96深孔板的單個(gè)孔中，并提供給Long String VANTAGE。在對(duì)層疊在洗脫板頂部的條帶進(jìn)行裂解和消化、結(jié)合、洗滌和Disk轉(zhuǎn)移后，在室溫下以2200 rcf對(duì)洗脫板組件進(jìn)行離心1分鐘。

該方法成功的得到驗(yàn)證，每次可處理12個(gè)樣品。使用相同參數(shù)共進(jìn)行了4次驗(yàn)證試驗(yàn)（3次試驗(yàn)，4個(gè)樣品，1次試驗(yàn)，12個(gè)樣品）。

在Long String VANTAGE上洗脫UHMW DNA后，使用標(biāo)準(zhǔn)200μL吸頭將樣品剪切4次，然后在Hula混合器上進(jìn)行1小時(shí)顛倒混勻，并在室溫下孵育過(guò)夜。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用Qubit dsDNA BR檢測(cè)試劑盒對(duì)UHMW DNA進(jìn)行定量。然后使用Bionano Prep直接標(biāo)記和染色（DLS）方案的優(yōu)化版本標(biāo)記DNA。根據(jù)系統(tǒng)用戶指南，使用Qubit 1X dsDNA HS檢測(cè)試劑盒對(duì)標(biāo)記的DNA進(jìn)行定量，并將其加載到Bionano芯片上，在Saphyr儀器上運(yùn)行。收集所有樣品大于150kbp分子的400Gbp光學(xué)數(shù)據(jù)。

技術(shù)

Hamilton專有的磁棒技術(shù)確保了較佳的Magnetic Disk處理。Paramagnetic Disk可通過(guò)5ml移液通道直接操作，無(wú)需額外的臺(tái)面設(shè)備。可調(diào)參數(shù)設(shè)置確保較佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Hamilton Magrod套筒以較高的精度制造，并根據(jù)可能的較佳Magnetic Disk定位進(jìn)行塑形。匹配可保護(hù)Magrod免受周圍液體和試劑的影響。Hamilton洗脫條用于通過(guò)離心從最終UHMW DNA樣品中分離Magnetic Disk。Disk保留在條帶中，而洗脫液被吸入微量滴定板。

結(jié)果

自動(dòng)化過(guò)程獲得的結(jié)果表明，樣品產(chǎn)率是可重復(fù)的，并符合Bionano Prep SP冷凍細(xì)胞沉淀DNA分離方案（圖A，藍(lán)條）中規(guī)定的手動(dòng)提取的預(yù)期值。

DLS標(biāo)記后進(jìn)行額外的樣品濃度測(cè)量，以確保有足夠的產(chǎn)量用于進(jìn)一步處理（圖A，灰點(diǎn)）。數(shù)據(jù)表明，對(duì)于在Long String VANTAGE上分離的所有樣品，都回收和體現(xiàn)了合適量的產(chǎn)物DNA。

在Saphyr儀器上運(yùn)行的樣本數(shù)據(jù)分析表明，分子長(zhǎng)度超過(guò)了Bionano Genomics提供的閾值，并證明存在大于230 kbp的超高分子量DNA（圖B）。從Hamilton Long String VANTAGE分離的DNA包含Mbp長(zhǎng)度的分子，在提取、標(biāo)記、線性化和成像后，其總體上超過(guò)了230 kbp的OGM質(zhì)量閾值。

從Saphyr儀器收集的數(shù)據(jù)中得出了進(jìn)一步的質(zhì)量控制指標(biāo)（下圖）。所有樣本在特異性和靈敏度范圍內(nèi)均顯示出一致的標(biāo)記性能（下圖A、B）。Map率超過(guò)了Bionano Genomics提供的質(zhì)量指標(biāo)閾值（下圖C）。

Long String VANTAGE可在一個(gè)工作日（8小時(shí)）內(nèi)處理多達(dá)12個(gè)樣品。這比手動(dòng)方法的效率顯著增加，建議每次運(yùn)行6個(gè)樣本。

結(jié)論

作為精密自動(dòng)化液體處理的專家和對(duì)基因組工作流程的關(guān)注，Hamilton正在進(jìn)入這個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域。我們與Bionano Genomics合作，建立了超高分子量DNA提取自動(dòng)化解決方案。結(jié)合光學(xué)基因組作圖，Long String VANTAGE將能夠以從樣本中標(biāo)準(zhǔn)化且可重復(fù)地提取超高分子量DNA，賦能您的基因研究。